背景

細菌培養基的光密度(OD)測定是微生物學中使用的 一種常見技術。研究人員主要依靠分光光度計來進行 這些測定,然而實際上這個測定是基于培養基的光散 射量而不是光吸收量。在其標準配置中,分光光度計 并未對光散射測定進行優化,這通常會導致儀器間所 測得吸光度上的差異。 方法 該研究調查了不同的分光光度計光學配置對在分批培 養基中生長的大腸桿菌JM109光密度測定的影響。 分光光度計檢測包括了使用陣列檢測的反向光學系 統、基于單色器的傳統系統以及一種配備積分球配件 sA)的單色器系統。在每個儀器上測定OD600生 長曲線,同時,對 McFarland進行 CFU/mL計數來進 步對每個光學系統進行鑒定。

結果

來自相同光學配置類別的分光光度計其OD數據是相當 的。用反向光學系統測定較高OD時數據變化更大, 這是由較低雜散光所導致?；趩紊鞯南到y測試較 高D時準確度較高,主要是因為與來自反向光學系統 的多色光相比,單色光具有更好的雜散光去除能力。 然而,反向光學系統測定OD時卻有具有良好的動態 范圍。使用SA產生出的數據與用其它系統產生出的 數據不同,這是因為其具有捕提幾乎所有前向散射光 的能力。而對 McFarland標準品的測定確認了這些現 象。

結論

分光光度計進行可靠的光散射測定的能力在很大程度 上取決于其光學配置:因此,具有不同光學配置的分 光光度計會呈現出不同的OD測定值。理想狀態下,高 度散射樣品(如細胞培養基)的吸光度是使用SA進 行測定的,目的是為了捕捉幾乎所有的散射光。培養 基生長可使用D60測定,然而每當改變分光光度計 時,就應該計算和應用一個換算因數。

引言

培養基中細菌生長(遲級期、對數生長期、穩定生長 期和衰亡期)各個階段都能記錄下來,其中對數期被 認為是細菌分裂最快的階段(1)。使用分光光度計 測定細菌培養基在600nm(OD600)時的光密度,從 而監控細菌生長一直是微生物學中的一種核心技術 使用細菌OD600的三種更為常見的應用如下:(a) 在細菌表達蛋白質時,找到誘導蛋白的最佳時間, (b)用于最小抑菌濃度(MC)實驗的接種體濃度的 確定和標準化,和(c)收獲和制備感受態細胞的最 佳時間的確定。研究人員繼續依靠分光光度計進行這 些OD測定。然而,光密度不是一個吸光度指標,而是 細菌混懸液的一種光散射指標,將其自身作為吸光度 顯示(圖1)。分光光度計光學配置對光密度測定的 影響得到了很好的記錄(2-4),具有不同光學配置 的儀器對同一細菌混懸液測定得到了不同的光密度。 分光光度計光學配置上的差異對觀察到的差異影響最 大。前向光學系統采用單色光來進行吸光度的測定, 而反向光學系統則利用多色輻射進行測定,光在其穿 過樣品后再區分成單獨波長(圖2)。前向光學系統 的一些要素導致了測得OD值上的差異:(a)樣品與 檢測器之間的距離,(b)聚光透鏡的尺寸和焦距大 小不同,和(c)檢測器的面積和靈敏度(5),盡管 現在都知道不同的光學配置會產生不同的OD值,但是 研究人員仍繼續關注在不同分光光度計間發現的OD值 差異在本研究中,我們分析了多種光學配置分光光 度計測出的D值差異,我們在分批培養基中培養大腸 桿菌M109,并監控QD達95小時。在測定之前稀釋 培養基,并將由于不同分光光度計光學元件差異造成 的不同CD值進行換算。

表1 Thermo Scientific分光光度計

結果

從未稀釋和稀釋的培養基中收集的OD600數據如圖3 所示。將來自稀釋溶液的OD600值乘以稀釋因數,并 與未稀釋的樣品進行對比。兩張圖的分歧表明,不同 的光學配置在光密度測定方面會有不同的動態范圍。 當對比每個分光光度計的校正OD值與細胞計數時,我 們發現,隨著時間的推移,具有相似光學系統的儀器 產生了相似的OD曲線(圖4)。具有前向光學系統 但卻是雙光束光學幾何結構的 BroMate3S,與儀器組 的差異最大。 McFarland數據呈現出一種與大腸桿菌 生長相似的曲線(圖5)。|SA使用 McFarland標準品 產生了更低的光密度(圖6)。

結論 計算OD測定值時,確定您所用分光光度計的光密度 性能和動態范圍是至關重要的。為獲得有關生長曲 線的最準確信息,稀釋細胞混懸液是很重要的。 ·OD測定在很大程度上取決于光學系統和幾何學。對 于相同的混懸液,具有不同光學系統和配置的分光 光度計會讀出不同的OD值。例如,在反向光學系統 Evolution Array和前向光學系統,雙光束 BroMate3S 之間有實質性的分歧。

積分球配件(ISA)可捕捉幾乎所有的前向散射光, 從而產生了更低的光密度。這是因為通?？雌饋肀? 樣品吸收的散射光實際上是被ISA配件所收集。ISA 對測定高度散射溶液中分析成分的吸光度是理想之 選;然而,在測定細胞混懸液的光密度時,其是無 效的。

最后,我們提出了如何計算一個可用于使OD數據標 準化,以便能在不同分光光度計間進行適當比較的 換算因數。值得注意的是,這個換算因數是針對 種特定的有機體,因為微粒的尺寸和形狀會影響換 算因數

參考文獻

1. Daniel R. Caldwell, Microbial Physiology and Metabolism (Wm. C. Brown Publishers, 1995), 55-59

2. Arthur L. Koch, “Turbidity Measurements of Bacterial Cultures in Some Available Commercial Instruments,” Analytical Biochemistry 38 (1970): 252-59

3. Arthur L. Koch, “Theory of the Angular Dependence of Light Scattered by Bacteria and Similar-sized Biological Objects,” Journal of Theoretical Biology 18 (1968): 133-56

4. J.V. Lawrence and S. Maier, “Correction for the Inherent Error in Optical Density Readings,” Applied and Environmental Microbiology Feb. (1977): 482-84

5. Gordon Bain, “Measuring Turbid Samples and Turbidity with UV-Visible Spectrophotometers,” Thermo Scientific Technical Note 51811