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            不同分光光度計間細菌光密度測定的差異分析日期:2019-8-30 13:03:11    瀏覽次數:1111    來源:http://www.gydkdxbyy.com

            背景

            細菌培養基的光密度(OD)測定是微生物學中使用的 一種常見技術。研究人員主要依靠分光光度計來進行 這些測定,然而實際上這個測定是基于培養基的光散 射量而不是光吸收量。在其標準配置中,分光光度計 并未對光散射測定進行優化,這通常會導致儀器間所 測得吸光度上的差異。 方法 該研究調查了不同的分光光度計光學配置對在分批培 養基中生長的大腸桿菌JM109光密度測定的影響。 分光光度計檢測包括了使用陣列檢測的反向光學系 統、基于單色器的傳統系統以及一種配備積分球配件 sA)的單色器系統。在每個儀器上測定OD600生 長曲線,同時,對 McFarland進行 CFU/mL計數來進 步對每個光學系統進行鑒定。

            結果

            來自相同光學配置類別的分光光度計其OD數據是相當 的。用反向光學系統測定較高OD時數據變化更大, 這是由較低雜散光所導致?;趩紊鞯南到y測試較 高D時準確度較高,主要是因為與來自反向光學系統 的多色光相比,單色光具有更好的雜散光去除能力。 然而,反向光學系統測定OD時卻有具有良好的動態 范圍。使用SA產生出的數據與用其它系統產生出的 數據不同,這是因為其具有捕提幾乎所有前向散射光 的能力。而對 McFarland標準品的測定確認了這些現 象。

            結論

            分光光度計進行可靠的光散射測定的能力在很大程度 上取決于其光學配置:因此,具有不同光學配置的分 光光度計會呈現出不同的OD測定值。理想狀態下,高 度散射樣品(如細胞培養基)的吸光度是使用SA進 行測定的,目的是為了捕捉幾乎所有的散射光。培養 基生長可使用D60測定,然而每當改變分光光度計 時,就應該計算和應用一個換算因數。

            引言

            培養基中細菌生長(遲級期、對數生長期、穩定生長 期和衰亡期)各個階段都能記錄下來,其中對數期被 認為是細菌分裂最快的階段(1)。使用分光光度計 測定細菌培養基在600nm(OD600)時的光密度,從 而監控細菌生長一直是微生物學中的一種核心技術 使用細菌OD600的三種更為常見的應用如下:(a) 在細菌表達蛋白質時,找到誘導蛋白的最佳時間, (b)用于最小抑菌濃度(MC)實驗的接種體濃度的 確定和標準化,和(c)收獲和制備感受態細胞的最 佳時間的確定。研究人員繼續依靠分光光度計進行這 些OD測定。然而,光密度不是一個吸光度指標,而是 細菌混懸液的一種光散射指標,將其自身作為吸光度 顯示(圖1)。分光光度計光學配置對光密度測定的 影響得到了很好的記錄(2-4),具有不同光學配置 的儀器對同一細菌混懸液測定得到了不同的光密度。 分光光度計光學配置上的差異對觀察到的差異影響最 大。前向光學系統采用單色光來進行吸光度的測定, 而反向光學系統則利用多色輻射進行測定,光在其穿 過樣品后再區分成單獨波長(圖2)。前向光學系統 的一些要素導致了測得OD值上的差異:(a)樣品與 檢測器之間的距離,(b)聚光透鏡的尺寸和焦距大 小不同,和(c)檢測器的面積和靈敏度(5),盡管 現在都知道不同的光學配置會產生不同的OD值,但是 研究人員仍繼續關注在不同分光光度計間發現的OD值 差異在本研究中,我們分析了多種光學配置分光光 度計測出的D值差異,我們在分批培養基中培養大腸 桿菌M109,并監控QD達95小時。在測定之前稀釋 培養基,并將由于不同分光光度計光學元件差異造成 的不同CD值進行換算。

            光密度測定

            材料和方法:
            菌株:E.coli JM109-endA1,recA1, gyrA96, thi, hsdR17(rk–, mk+), relA1, supE44, (lac-proAB), [F′traD36,proAB, laqlqZ M15] (Promega, L2001)分光光度計:所使用的Thermo Scientifific 分光光度計會在表1中描述。
            生長曲線: 50mL過夜大腸桿菌JM109在250mL帶擋板的培養瓶中培養,于Luria Bertani(LB)培養液中生長(16小時,250rpm,37℃)。將12mL的過夜菌液轉移至一個2L帶擋板培養瓶中培養,加入37℃預熱的LB培養基600ml,培養9.5小時。
            培養基取樣:所有分光光度計均使用LB培養液做空白對照。每隔30分鐘從分批培養基中取一個5mL等份試樣。將3mL等份的未稀釋培養基轉移至一個10mm比色皿中,并采用表1中列出的所有儀器測定600nm時的光密度。LB培養液稀釋過的等份分批培養基加入第二個10mm比色皿中。進行此第二次OD測定是為了確保培養基的光密度保持在分光光度計的動態OD范圍內。
            活菌計數:每隔30分鐘,也將一等份樣品進行一系列稀釋。將稀釋液涂在LB瓊脂板上,并在37℃下過夜培養。對菌落進行計數,來測定各時間點的細菌細胞計數(CFU/mL)。
            McFarland標準品:通過使用1cm路徑長度的比色皿,在各儀器(表1)上對來自四個McFarland標準品 (Remel, R20421, 1.0-4.0)進行OD600值測定。

            表1 Thermo Scientific分光光度計

            儀器

            光學系統

            光學幾何學

            光源

            檢測器

            Evolution Aray

            反向光學

            氘和鎢燈光

            光電二極管陣列

            NanoDrop2000c

            反向光學

            氙燈

            CMOS陣列

            SPECTRONIC200

            反向光學

            鎢燈

            CCD陣列

            Evolution260Bio

            前向光學

            前向光學

            氙燈

            硅光電二極管

            Evolution300

            前向光學

            前向光學

            氙燈

            硅光電二極管

            BroMate3S

            前向光學

            雙光束

            氙燈

            硅光電二極管

            從未稀釋和稀釋的培養基中收集的OD600數據如圖3 所示。將來自稀釋溶液的OD600值乘以稀釋因數,并 與未稀釋的樣品進行對比。兩張圖的分歧表明,不同 的光學配置在光密度測定方面會有不同的動態范圍。 當對比每個分光光度計的校正OD值與細胞計數時,我 們發現,隨著時間的推移,具有相似光學系統的儀器 產生了相似的OD曲線(圖4)。具有前向光學系統 但卻是雙光束光學幾何結構的 BroMate3S,與儀器組 的差異最大。 McFarland數據呈現出一種與大腸桿菌 生長相似的曲線(圖5)。|SA使用 McFarland標準品 產生了更低的光密度(圖6)。

            結論 計算OD測定值時,確定您所用分光光度計的光密度 性能和動態范圍是至關重要的。為獲得有關生長曲 線的最準確信息,稀釋細胞混懸液是很重要的。 ·OD測定在很大程度上取決于光學系統和幾何學。對 于相同的混懸液,具有不同光學系統和配置的分光 光度計會讀出不同的OD值。例如,在反向光學系統 Evolution Array和前向光學系統,雙光束 BroMate3S 之間有實質性的分歧。

            積分球配件(ISA)可捕捉幾乎所有的前向散射光, 從而產生了更低的光密度。這是因為通??雌饋肀? 樣品吸收的散射光實際上是被ISA配件所收集。ISA 對測定高度散射溶液中分析成分的吸光度是理想之 選;然而,在測定細胞混懸液的光密度時,其是無 效的。

            最后,我們提出了如何計算一個可用于使OD數據標 準化,以便能在不同分光光度計間進行適當比較的 換算因數。值得注意的是,這個換算因數是針對 種特定的有機體,因為微粒的尺寸和形狀會影響換 算因數

            參考文獻

            1. Daniel R. Caldwell, Microbial Physiology and Metabolism (Wm. C. Brown Publishers, 1995), 55-59

            2. Arthur L. Koch, “Turbidity Measurements of Bacterial Cultures in Some Available Commercial Instruments,” Analytical Biochemistry 38 (1970): 252-59

            3. Arthur L. Koch, “Theory of the Angular Dependence of Light Scattered by Bacteria and Similar-sized Biological Objects,” Journal of Theoretical Biology 18 (1968): 133-56

            4. J.V. Lawrence and S. Maier, “Correction for the Inherent Error in Optical Density Readings,” Applied and Environmental Microbiology Feb. (1977): 482-84

            5. Gordon Bain, “Measuring Turbid Samples and Turbidity with UV-Visible Spectrophotometers,” Thermo Scientific Technical Note 51811

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